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黃曲霉毒素M1免疫親和柱操作說明書

【概要】

黃曲霉毒素（Aflatoxin）是黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃分為1類致癌物，同時又是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，廣泛存在于各種食物中。玉米，花生，大米，小麥等谷物及其副產(chǎn)品是黃曲霉毒素的主要來源，同時飼料中的黃曲霉毒素B1經(jīng)過動物代謝后產(chǎn)生的黃曲霉毒素M1仍然具有很強(qiáng)的毒性和致癌性，也廣泛存在牛奶，血液，組織等食品中。黃曲霉毒素作為肝癌的三大誘因之一，也是胃癌，腸癌等疾病的主要原因，對人類的健康構(gòu)成很大威脅。世界各國對食品，飼料中的黃曲霉毒素都有嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。2010年6月1日開始施行的乳品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中對乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測進(jìn)行了規(guī)定，主要使用的樣品前處理方法就是免疫親和柱凈化法。

【適用范圍及性能】

用于定性、定量檢測牛奶，奶粉，發(fā)酵乳，干酪，奶油等樣品中黃曲霉毒素M1的樣品前處理。

柱容量：≥200ng

回收率：≥90%

【試驗原理】

本產(chǎn)品的測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，黃曲霉毒素M1單克隆抗體連接在柱內(nèi)凝膠上，樣品中的黃曲霉毒素M1經(jīng)過提取、過濾、稀釋，然后將樣品提取液緩慢的通過黃曲霉毒素M1免疫親和層析柱，在免疫親和柱內(nèi)，毒素與抗體結(jié)合，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結(jié)合的其他物質(zhì)。用甲醇洗脫黃曲霉毒素M1，然后注入到分析儀器中用于檢測。

【包裝組成】

根據(jù)不同規(guī)格，每一個盒中包含5-25支黃曲霉毒素免疫親和層析柱及1份說明書。

【需要而未提供的設(shè)備及試劑】

設(shè)備：

┅┅高速均質(zhì)器或組織勻漿機(jī)

┅┅粉碎機(jī)

┅┅200mL/50mL量筒

┅┅天平：感量0.1g

┅┅酸度計

┅┅分液漏斗

┅┅微量移液器：單道 100?L～1000?L

┅┅槽紋濾紙（折疊快速定性或定量濾紙）

┅┅50mL漏斗

┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

┅┅一次性玻璃試管

┅┅泵流操作架（包括空氣泵，不同容積的玻璃注射器等）

┅┅燒杯，容量瓶，錐形瓶等

試劑：

┅┅甲醇（色譜級）

┅┅乙腈（色譜級）

┅┅石油醚

┅┅蒸餾水或去離子水

┅┅氫氧化鈉溶液（0.5mol/L）稱取2g氫氧化鈉溶解于100mL水中

【樣本處理步驟】

（一）牛奶

┅┅將100mL牛奶水浴加熱至40 oC；

┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（二）乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品

┅┅稱取10g奶粉樣品，將100mL50 oC水多次少量加入，攪拌，使奶粉充分溶解

┅┅6000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（三）發(fā)酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)

┅┅稱取60 g混勻的試樣，用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計指示下調(diào)pH至7.4；

┅┅用高速均質(zhì)器在 9500 轉(zhuǎn)/分鐘下告訴勻漿5 min

┅┅水浴加熱至40 oC；

┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（四）干酪

┅┅稱取經(jīng)切細(xì)、過10目圓孔篩混勻的試樣5g置于50 mL離心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；

┅┅用高速均質(zhì)器在 9500r/分鐘下告訴勻漿5 min；

┅┅超聲提取30 min；

┅┅在6000r/分鐘下離心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

┅┅在分液漏斗中加入30 mL石油醚（4.3），振搖2 min；

┅┅待分層后，將下層移于50 mL燒杯中，棄去石油醚層。

┅┅重復(fù)用石油醚提取2次；。

┅┅將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL；┅┅濃縮液倒入離心管中，燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌，洗滌液一并倒入50 mL離心管中；

┅┅加水稀釋至約50 mL，在6000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心 5 min，上清液供凈化處理。

（五）奶油

┅┅稱取5g試樣，置于50 mL燒杯中；

┅┅用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。

┅┅加20 mL水和30 mL甲醇，振蕩30 min后，將全部液體移于分液漏斗中；

┅┅待分層后，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5 mL，加水稀釋至約50mL，供凈化處理。

【親和柱凈化步驟】

┅┅將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL清澈液注入玻璃注射器；

┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2-3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；

┅┅在注射器中加入10ml水，調(diào)節(jié)壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。

┅┅準(zhǔn)確加入1mL色譜級乙腈洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

【結(jié)果判定】

經(jīng)免疫親和柱凈化后，收集到的乙腈洗脫液可直接使用熒光計或者HPLC檢測，也可使用薄層色譜或者酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測。收集到的1ml洗脫液中的黃曲霉毒素含量相當(dāng)于10ml牛奶樣品、發(fā)酵乳樣品或者1g奶粉樣品、干酪樣品和奶油樣品中黃曲霉毒素M1的含量。

如果HPLC檢測需要其它溶劑，可以將乙腈洗脫液氮氣吹干，然后復(fù)溶

【注意事項】

┅┅黃曲霉毒素危害極大，應(yīng)戴手套操作。

┅┅使用過的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液最好用5%濃度的次氯酸鈉溶液浸泡過夜。

┅┅不要使用過了有效日期的免疫親和柱。

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：親和柱可于常溫保存，2-8℃儲存可延長有效期，不可凍存。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。